Fluoresenssisuodatin on olennainen osa fluoresenssimikroskoopissa.Tyypillisessä järjestelmässä on kolme perussuodatinta: virityssuodatin, emissiosuodatin ja dikroinen peili.Ne pakataan yleensä kuutioon niin, että ryhmä työnnetään yhdessä mikroskooppiin.
Kuinka fluoresenssisuodatin toimii?
Herätyssuodatin
Virityssuodattimet lähettävät tietyn aallonpituuden valoa ja estävät muita aallonpituuksia.Niitä voidaan käyttää tuottamaan eri värejä säätämällä suodatin päästämään vain yksi väri läpi.Herätyssuodattimia on kahta päätyyppiä - pitkäpäästösuodattimet ja kaistanpäästösuodattimet.Herätin on yleensä kaistanpäästösuodatin, joka läpäisee vain fluoroforin absorboimat aallonpituudet, minimoiden siten muiden fluoresenssilähteiden virittymisen ja estämällä viritysvalon fluoresenssiemissiokaistalla.Kuten kuvan sininen viiva osoittaa, BP on 460-495, mikä tarkoittaa, että se voi läpäistä vain fluoresenssin 460-495 nm.
Se sijoitetaan fluoresenssimikroskoopin valaistusreitille ja suodattaa pois kaikki valonlähteen aallonpituudet fluoroforin viritysaluetta lukuun ottamatta.Suodattimen vähimmäislähetys sanelee kuvien kirkkauden ja kirkkauden.Jokaiselle virityssuodattimelle suositellaan vähintään 40 %:n lähetystä, jotta siirto olisi ihanteellisesti >85 %.Virityssuodattimen kaistanleveyden tulee olla kokonaan fluoroforin viritysalueen sisällä siten, että suodattimen keskiaallonpituus (CWL) on mahdollisimman lähellä fluoroforin viritysaallonpiippua.Virityssuodattimen optinen tiheys (OD) sanelee taustakuvan tummuuden;OD on mitta siitä, kuinka hyvin suodatin estää aallonpituudet lähetysalueen tai kaistanleveyden ulkopuolella.OD:ksi suositellaan vähintään 3,0, mutta OD:n 6,0 tai suurempi on ihanteellinen.
Päästösuodatin
Emissiosuodattimien tarkoitus on päästää haluttu fluoresenssi näytteestä ilmaisimeen.Ne estävät lyhyempiä aallonpituuksia ja niillä on korkea lähetys pidemmille aallonpituuksille.Suodatintyyppiin liittyy myös numero, esim. kuvassa BA510IF (häiriösulkusuodatin), joka tarkoittaa aallonpituutta 50 %:lla sen maksimiläpäisystä.
Samat virityssuodattimia koskevat suositukset pätevät emissiosuodattimiin: minimilähetys, kaistanleveys, OD ja CWL.Emissiosuodatin, jossa on ihanteellinen CWL-, minimiläpäisy- ja OD-yhdistelmä, tarjoaa kirkkaimmat mahdolliset kuvat, mahdollisimman syvimmät estot ja varmistavat heikoimpien emissiosignaalien havaitsemisen.
Dikroinen peili
Dikroinen peili sijoitetaan virityssuodattimen ja emissiosuodattimen väliin 45° kulmassa ja heijastaa virityssignaalia kohti fluoroforia samalla kun se lähettää emissiosignaalin kohti ilmaisinta.Ihanteellisissa dikroisissa suodattimissa ja säteenjakajissa on terävät siirtymät maksimiheijastuksen ja maksimiläpäisyn välillä, jolloin virityssuodattimen kaistanleveyden heijastus on >95 % ja emissiosuodattimen kaistanleveys yli 90 %.Valitse suodatin fluoroforin leikkausaallonpituuden (λ) mukaisesti minimoidaksesi hajavalon ja maksimoidaksesi fluoresoivan kuvan signaali-kohinasuhteen.
Tämän kuvan dikroinen peili on DM505, joka on nimetty siksi, että 505 nanometriä on aallonpituus 50 %:lla tämän peilin maksimiläpäisystä.Tämän peilin läpäisykäyrä osoittaa korkeaa läpäisyä yli 505 nm:ssä, jyrkkää läpäisyssä 505 nanometrin vasemmalla puolella ja maksimiheijastavuuden vasemmalla puolella 505 nanometriä, mutta silti saattaa olla jonkin verran läpäisyä alle 505 nm.
Mitä eroa on pitkän ja kaistanpäästösuodattimen välillä?
Fluoresenssisuodattimet voidaan jakaa kahteen tyyppiin: pitkäpäästö (LP) ja kaistanpäästö (BP).
Pitkäpäästösuodattimet lähettävät pitkiä aallonpituuksia ja estävät lyhyemmät.Raja-aallonpituus on arvo, joka on 50 % huippuläpäisystä, ja kaikki raja-arvon yläpuolella olevat aallonpituudet lähetetään pitkäpäästösuodattimilla.Niitä käytetään usein dikroisissa peileissä ja päästösuodattimissa.Longpass-suodattimia tulee käyttää, kun sovellus edellyttää maksimaalista emissiokeräystä ja kun spektrinen erottelu ei ole toivottavaa tai tarpeellista, mikä on yleensä tilanne koettimissa, jotka tuottavat yhden emittoivan lajin näytteissä, joiden taustan autofluoresenssitaso on suhteellisen alhainen.
Kaistanpäästösuodattimet lähettävät vain tietyn aallonpituuskaistan ja estävät muita.Ne vähentävät ylikuulumista sallimalla vain fluoroforien emissiospektrin voimakkaimman osan lähettämisen, vähentävät autofluoresenssikohinaa ja parantavat siten signaali-kohinasuhdetta korkean taustan autofluoresenssinäytteissä, joita pitkäpäästösuodattimet eivät pysty tarjoamaan.
Kuinka monta erilaista fluoresenssisuodatinsarjaa BestScope voi toimittaa?
Joitakin yleisiä suodatintyyppejä ovat siniset, vihreät ja ultraviolettisuodattimet.Kuten taulukosta näkyy.
| Suodatinsarja | Herätyssuodatin | Dikroinen peili | Estesuodatin | LED-lamppu Aallonpituus | Sovellus |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Fluoresoiva vasta-ainemenetelmä ·Acidiinioranssi: DNA, RNA ·Auramiini: Tubercle bacillus ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluoresoiva vasta-ainemenetelmä ·Propidiumjodidi: DNA · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Auto-fluoresenssihavainto ·DAPI: DNA-värjäys ·Hoechest 332528, 33342: käytetään kromosomivärjäykseen |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Katekoliamiinit ·5-hydroksitryptamiini ·Tetrasykliini: luuranko, hampaat |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Sy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Fluoresenssin hankinnassa käytettävät suodatinsarjat on suunniteltu fluoresenssisovelluksissa käytettävien tärkeimpien aallonpituuksien ympärille, mikä perustuu eniten käytettyihin fluoroforeihin.Tästä syystä ne on nimetty myös kuvantamiseen tarkoitetun fluoroforin mukaan, kuten DAPI (sininen), FITC (vihreä) tai TRITC (punainen) suodatinkuutiot.
| Suodatinsarja | Herätyssuodatin | Dikroinen peili | Estesuodatin | LED-lamppu Aallonpituus |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP 360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramiini | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texasin punainen | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Miten valitset fluoresenssisuodattimen?
1. Fluoresenssisuodattimen valinnan periaate on antaa fluoresenssi-/emissiovalon kulkea kuvantamispään läpi niin pitkälle kuin mahdollista ja samalla kokonaan estää viritysvalon, jotta saavutetaan suurin signaali-kohinasuhde.Erityisesti monifotoniviritteen ja sisäisen kokonaisheijastusmikroskoopin sovelluksissa heikko kohina aiheuttaa myös suuria häiriöitä kuvantamisvaikutukseen, joten signaali-kohinasuhteen vaatimus on korkeampi.
2. Tunne fluoroforin viritys- ja emissiospektri.Fluoresenssisuodatinsarjan rakentamiseksi, joka tuottaa korkealaatuisen, korkeakontrastisen kuvan mustalla taustalla, viritys- ja emissiosuodattimien tulisi saavuttaa korkea lähetys ja minimaalinen päästökaistan aaltoilu alueilla, jotka vastaavat fluoroforin virityshuippuja tai päästöjä.
3. Ota huomioon fluoresenssisuodattimien kestävyys.Näiden suodattimien on oltava läpäisemättömiä voimakkaille valonlähteille, jotka tuottavat ultraviolettivaloa (UV-valoa), joka voi johtaa "palamiseen", erityisesti herätesuodattimen, koska se altistetaan valonlähteen täydelle voimakkuudelle.
Erilaiset fluoresoivat näytekuvat
Resurssit kerätään ja järjestetään Internetissä, ja niitä käytetään vain oppimiseen ja viestintään.Jos rikkomuksia ilmenee, ota meihin yhteyttä poistaaksesi.
Postitusaika: 09.12.2022